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技術(shù)文章

細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

點擊次數(shù):17371   發(fā)布時間:2021/5/26 21:41:03

 細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物,ERK1/2激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下,受到ERK1/2激酶磷酸化后,進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng),測定產(chǎn)生ADP過程中,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反應, 即采用光度法測定其氧化后吸光峰值的變化,以分析細胞裂解樣品中ERK1/2激酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品(動物、人體)、部分或完quan純化酶樣品中ERK1/2激酶的定量檢測,以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定,高度敏感。 

細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)技術(shù)背景

細胞外信號調(diào)節(jié)性激酶(extracellular signal regulated kinase;ERK;EC,又稱為經(jīng)典促分裂素原活化蛋白激酶(classical mitogen activated protein kinase),屬于促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)一類中,包括JNKc-Jun amino terminal kinase)、ERKP38、Big MAPK1等的一員。在哺乳動物細胞中,促分裂素原活化蛋白激酶通路包含有三大通路,Erk信號通路是其中,高度進化保留。Erk/MAPK是脯氨酸定向性絲氨酸/蘇氨酸(serine/threonine)蛋白激酶,在大多數(shù)組織中表達。和P38、JNK通路一起,將細胞外信號轉(zhuǎn)化為特定細胞反應。Erk通路受到各種刺激例如生長因子、細胞因子、病毒感染、腫瘤因子等,由受體信號傳導到細胞核內(nèi)的目標分子,通過Ras磷酸化Raf,進而激活MAP激酶激酶12MEK12),再磷酸化Erk激酶,然后激活一系列下游底物,包括核糖體S6激酶(ribosomal S6 kinaseRSK、轉(zhuǎn)錄因子、髓鞘堿性蛋白myelin basic protein等,以調(diào)節(jié)細胞生長、繁殖、分化、壓力生存(stress survival、減數(shù)分裂、有絲分裂、細胞形態(tài)維持、細胞骨架的構(gòu)建、細胞凋亡和細胞的惡變Erk激酶5型,其中主要分為1型和2型,其中1型又稱為MAPK3,44Kd分子量,主要調(diào)節(jié)胸腺細胞成熟;2型又稱為MAPK1,42Kd分子量。Erk通路異常,與乳腺癌、卵巢癌、列腺癌等發(fā)生有關。Erk磷酸化目標序列為髓鞘堿性蛋白性多肽ATGPLSPGPFGRR。基于底物ATGPLSPGPFGRR,在ERK1/2激酶敏感性抑制劑FR1802045-(2-Phenyl-pyrazolo[1,5-a]pyridin-3-yl)-1H-pyrazolo[3,4-c]pyridazin-3-ylamine)的存在與否的情況下,受到ERK1/2激酶的磷酸化,獲得產(chǎn)物磷酸化多肽,進而通過丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase;LDH)反應系統(tǒng)中,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotideNADH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的變化(340nm),來定量分析ERK1/2激酶的總活性。其反應方式為:

細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)產(chǎn)品內(nèi)容 

清理液(Reagent A 毫升

裂解液(Reagent B 毫升

緩沖液(Reagent C 毫升

酶促液(Reagent D 微升

反應液(Reagent E 微升

底物液(Reagent F 微升

陰性液(Reagent G 微升

性液(Reagent H 微升

產(chǎn)品說明書   1

保存方式

保存清理液(Reagent A4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里,嚴格避免光照和反復凍融;保質(zhì)期:6

細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)用戶自備

ERK1/2激酶:用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒:用于貼壁細胞脫離

(微型)臺式離心機:用于樣品預處理

比色皿或96孔板:用于光分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀:用于樣品光分析 

實驗步驟 

一、 待測樣品準備

1. 準備好75cm2細胞培養(yǎng)瓶或100mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞(15 X 107細胞)

2. 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆蓋生長表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:避免使用胰酶消化

5. 加入xx毫升清理液(Reagent A,混勻細胞

6. 移入到預冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始

7. 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入xx微升裂解液(Reagent B,充分混勻

10. 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管

11. 強力渦旋震蕩15

12. 置于冰槽里孵育30分鐘

13. 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

14. 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-GMS30030.1

16. 即刻放進-70保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準備

1. 準備好待測樣品(例如細胞裂解懸液等),置于冰槽里 

2. 設定好分光光度儀(溫度為30℃):波長為340nm,間隔1分鐘,讀數(shù)6次(共5分鐘),并置零

3. 緩沖液(Reagent C室溫下均衡溫度 

三、 背景對照測定

1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入xx微升酶促液(Reagent D

3. 加入xx微升反應液(Reagent E

4. 加入xx微升底物液(Reagent F

5. 放進30培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6. 加入xx微升陰性液(Reagent G

7. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3之內(nèi))

8. 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照:340波長讀數(shù)0分鐘 340波長讀數(shù)5分鐘 

四、 樣總活性測定

1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入xx微升酶促液(Reagent D

3. 加入xx微升反應液(Reagent E

4. 加入xx微升底物液(Reagent F

5. 放進30培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6. 加入5微升待測樣品(注意:50微克細胞裂解蛋白;樣品須溶解

7. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3之內(nèi))

8. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品總活性讀數(shù):340波長讀數(shù)0分鐘 340波長讀數(shù)5分鐘 

五、 樣品非特異活性測定

檢測開始,移取xx微升緩沖液(Reagent C1.5毫升離心管,分別加入xx微升性液(Reagent H待測樣品(注意:50微克細胞裂解蛋白),混勻后,放進30培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入xx微升酶促液(Reagent D

3. 加入xx微升反應液(Reagent E

4. 加入xx微升底物液(Reagent F 

5. 放進30培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6. 加入20微升上述預處理的待測樣品

7. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3之內(nèi))

8. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品非特異活性讀數(shù):340波長讀數(shù)0分鐘 340波長讀數(shù)5分鐘

六、 計算樣品活性

1) 樣品總活性和非特異活性計算

2)樣品特異活性計算

七、酶標儀測定

1) 樣品總活性測定

1. 96孔板上做好相應標記:背景對照和樣品

2. 分別移取xx微升緩沖液(Reagent C96孔板

3. 分別加入xx微升酶促液(Reagent D

4. 分別加入xx微升反應液(Reagent E

5. 分別加入xx微升底物液(Reagent F

6. 輕輕搖動96孔板

7. 30℃溫度下孵育3分鐘

8. 分別加入xx微升陰性液(Reagent G待測樣品(50微克細胞裂解懸液蛋白)到相應孔(注意:樣品須清澈

9. 輕輕搖動96孔板

10. 即刻放進酶標儀檢測:0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

11. 活性計算:

2) 樣品非特異活性測定

檢測開始,移取xx微升緩沖液(Reagent C1.5毫升離心管,分別加入xx微升性液(Reagent H待測樣品(注意:50微克細胞裂解蛋白),混勻后,放進30培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

1. 96孔板上做好相應標記:待測樣品

2. 移取xx微升緩沖液(Reagent C96孔板

3. 加入xx微升酶促液(Reagent D

4. 加入xx微升反應液(Reagent E

5. 加入xx微升底物液(Reagent F 

6. 輕輕搖動96孔板

7. 30℃溫度下孵育3分鐘

8. 加入20微升上述預處理的待測樣品

9. 輕輕搖動96孔板

10. 即刻放進酶標儀檢測:0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

11. 活性計算:

3) 樣品特異活性計算

八、抑制劑篩選

1. 96孔板上做好相應標記:背景、完quan活性和待測抑制劑樣品

2. 按下表加入試劑,進行樣品預處理

內(nèi)容物

空背景對照

樣本背景

完quan酶活性

待測抑制劑酶活性

緩沖液(Reagent C

xx微升

xx微升

xx微升

xx微升

陰性液(Reagent G

xx微升

xx微升

xx微升

——

待測抑制劑

——

xx微升

――

xx微升

用戶自備的純化酶

——

——

xx微升1毫單位)

xx微升1毫單位)

96孔板每孔總量

空背景對照

xx微升)

樣本背景孔

xx微升)

完quan活性

xx微升)

待測抑制劑樣品

xx微升)

輕輕搖動96孔板,混勻,放進30培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進行下列操作

3. 分別移取xx微升緩沖液(Reagent C新的96孔板的所有

4. 分別加入xx微升酶促液(Reagent D

5. 分別加入xx微升反應液(Reagent E

6. 分別加入xx微升底物液(Reagent F 

7. 輕輕搖動96孔板

8. 30溫度下孵育3分鐘

9. 加入20微升上述預處理的待測樣品

10. 即刻放進30酶標儀檢測:測讀30分鐘

11. 抑制活性計算:

注意事項

1. 本產(chǎn)品為20次操作

2. 操作時,須戴手套

3. 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需1

4. 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5. 樣品須澄清,至關重要 

6. 如果出現(xiàn)明顯的干擾現(xiàn)象,建議使用樣本背景對照去除任何內(nèi)源性干擾因子

7. 加入樣品啟動反應3內(nèi)即刻光測定

8. 測定值由高到低變化;測定可持續(xù)30分鐘

9. 測定后,比色皿須清洗徹di

10. 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

11. 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升(本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-GMS30030.1

12. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度

13. ERK激酶活性單位濃度定義:在30溫度下,pH 7.5條件下,每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH所需的酶量作為一個活性單位

14. 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

使用承nuo

秉著信譽至上、客戶滿意、質(zhì)量承nuo的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)zhi產(chǎn)品和服務。用戶收到貨后,應按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有xiao期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售已作嚴格的質(zhì)量鑒定,bao證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題,請立即以書面形式(實驗報告)與本公司聯(lián)系,并將該產(chǎn)品退回,經(jīng)檢驗確系產(chǎn)品質(zhì)量所致,本公司負責更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致,本公司不承擔由此造成的損失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

訂購信息

單組分訂購信息

編號名稱規(guī)格

GMS50056.1.3細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒20

GMS50056.1.3A清理液(Reagent A   毫升

GMS50056.1.3B裂解液(Reagent B   毫升

GMS50056.1.3C 緩沖液(Reagent C    毫升

GMS50056.1.3D酶促液(Reagent D   毫升

GMS50056.1.3E 反應液(Reagent E    毫升

GMS50056.1.3F底物液(Reagent F   毫升

GMS50056.1.3G陰性液(Reagent G   毫升

GMS50056.1.3H性液(Reagent H   毫升

試劑盒訂購信息

產(chǎn)品編號

名稱

規(guī)格

GMS50056.1

細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒

20

GMS50056.2

組織ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒

20

GMS50159.1

細胞ERK1激酶活性光度法定量檢測試劑盒

20

GMS50159.2

組織ERK1激酶活性光度法定量檢測試劑盒

20

GMS50159.3

細胞ERK2激酶活性光度法定量檢測試劑盒

20

GMS50159.4

組織ERK2激酶活性光度法定量檢測試劑盒

20

  

原創(chuàng)作者:上海極威生物科技有限公司

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